목적 ELISA의 기본 원리를 이해하고 이를 활용하여 특정 단백질의 발현량을 측정하고 분석한다. 준비물 1. 기기/기구:PowerWave XS(ELISA reader), 37도 인큐베이터, 노트북, vortexHuman IL-6 microplate, Micro tube, Conical tube, Rack, Plate sealer, 피펫, 9채널 멀티피펫 Reagent reservoir, 와이프올, Waste bottle2. 시약/샘플:Human IL-6 standard, Control(NIL supernatant), Sample(FLS+IL-17 supernatant)Calibrator Diluent RD5T, Assay Diluent RD1W(bloking solution)Human IL-6 HPR-Conjugate, Wash Buffer, Substrate Solution(Color Reagent A+Color Reagent B), Stop solution(2 N sulfuric acid)실험 방법 1.Serial dilution 1)Human IL-6 Standard용액 333μ l함유된 microtube에 calibrator diluent RD5T 667μ l 넣어 희석>500pg/ml2)전의 용액을 500μ l로 다른 microtube에 옮기RD5T 500μ l>[반]0pg/mldls RD5T 500μ l준비 2. Control 6μ l+RD5T 294μ l에 50배 희석 3. Sample 6μ l+RD5T 294μ l에 50배 희석+매 단계 용액을 섞을 때 vortexing 4. 각 well에 8채널 멀티 피펫을 이용하고 100μ l의 assay diluent RD1W투입 5. 각 well에 희석된Human IL-6 standard&control&sample 100μ l씩
6.plate sealer에서 plate덮개 37번 인큐베이터에 1시간 반응 7.25xwash buffer를 DW에 25배 희석 8. 반응이 끝나면 각 well의 액체를 wastebottle에 털어내9.8채널 멀티 피펫으로 washbuffer 300μ l씩 각 well에 넣어 다시 wastebottle에 털어내과정을 3회 반복 10. 각 well에 8채널 멀티 피펫으로 200μ l Human IL-6_HRP-conjugate 넣고 11.plate seal인큐베이터 반응으로 덮는다.에 8채널 멀티 피펫으로 200μ l의 substrate solution을 넣고 15.plate sealer를 포일로 싼 상온에서 20분 보관 16. 각 well에 8채널 멀티 피펫으로 50μ l의 stop solution을 넣는 17.30분 이내에 ELISA reader로 흡광도 측정(450nm에서) 실험 결과 1. standard curve 작성
농도가 0일 때를 기준으로 보정한 상태
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1열과 2열 실험 결과 오차가 균일하지 않음과 동시에 크다.
2줄의 데이터가 크게 불안하니 준수한 R^2값을 나타내1줄의 데이터를 사용하여 작성한 스탠더드·커브를 받아들이기로 한다.2. 측정 시료의 단백질 농도 결정 1열과 2열을 비 비삽입 성교한 실험자가 다르지만 앞에서 1줄의 데이터를 신뢰하기로 하였고, 컨트롤과 sample의 흡수도 역시 1줄의 데이터를 받아들인다>control:0.07, sample:0.265sample-control이 우리가 원하는 단백질의 흡수도를 나타낸다. 1줄에 의한 standard curve경향선에 대입 때 0.195=0.0013x+0.0482>x=113pg/ml고찰 1열과 2열을 비 비삽입 성교한 실험자가 다른 것이 2개의 결과의 오차를 일으키는 요인이 될 수 있다고 생각. 단일 실험자가 순차적으로 모두 비 페팅을 했으면 더 일관된 결과를 얻었을지 모른다.2줄의 데이터가 이론적인 선형 구조에서 크게 어긋나고 R^2=0.7106에 지나지 않기 때문에 신뢰도가 낮은 배제했다. 이 상황에 큰 영향을 미치는 2줄-125pg/ml의 이상 데이터를 62.5pg/ml와 250pg/ml사이의 평균치에 대입하면 R^2=0.9503과 데이터 신뢰성이 뛰어나다. 이렇게 하면 2열의 데이터도 분석에 활용할 수 있다
3. 발색 모습을 촬영한 사진으로 분석한 결과 채도 %값이 다음과 같다. sample의 채도가 500pg/ml에서의 채도보다 낮으므로 이 또한 2열의 sample 값을 버리고 1열의 sample 값을 차용한 적당함을 제공한다.
3. 발색 모습을 촬영한 사진으로 분석한 결과 채도 %값이 다음과 같다. sample의 채도가 500pg/ml에서의 채도보다 낮으므로 이 또한 2열의 sample 값을 버리고 1열의 sample 값을 차용한 적당함을 제공한다.